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电子设备的安全性设计pdf

作者:10bet十博    发布时间:2019-07-30 15:11    点击:

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  nvironmen . talAtabi1i哆l环境适应性和可靠性_■ 电子设备的安全性设计 白伟,闻利群 (中北大学 化工与环境学院,太原 030051) 摘要:本电子设备安全性设汁的目的就是通过识别、分析、评价系统中存在的危险性,预计事故对人员、设备和环境 的破坏的可能性和严重性,根据其结果调整工艺、设备、操作、管理、生产周期和投资等因素,提出消除、减少、控 制危险及危险事件的措施,以便使事故在发生之前得到控制,降低系统运行的风险。 关键词:安全性;预计事故;破坏;消除;控制;降低 中图分类号:X934 文献标识码:A 文章编号:1004—7204 (2014)02—0040—04 TheSecurityDesignofElectronicEquipment BAIWei,WEN Li—qun (ChemicalEngineeringandEnvironment,NorthUniversityofChina,Taiyuan 030051) Abstract:The purpose of the electronic equipment’S security design iS through the risk existing in the identification,analysiS,evaluation system,to anticipate the possibility and severity of the accident to personne1, equipment and environment. According to the result, the factors that the process, equipment, operation, management,production cycle and investmentwere adjusted. The measurements to eliminate, reduce and control damage were put forward in order to control the aecidents before happened,andreduce the risk of system operation. Keywords: security:aceident:damage:eliminate:control:reduce 前言 电子设备在生产 、使用、维修各阶段中所出现的许 随着 2l世纪电气、电子技术的飞速发展 ,各类带有 多问题取决于设计阶段的安全性工作。例如 ,工作人员 高新科技的电气、电子产品出现在我们身边。它们的出 的操作 、设备的安全性设计、电磁信息安全设计等。在 现给我们现在的学习、工作和生活带来了很大的便捷。 研制阶段 ,对各种影响因素进行测定与统计分析,根据 但同时,电气 、电子产品的各种安全问题 已不容小觑。 其结果调整工艺、设备、操作、管理、生产周期和投资 为尽力避免、减少其对人身财产和环境所造成的危害, 等因素,提出消除、减少、控制危险及危险事件的措施, 世界各国纷纷实行了强制性产品认证制度作为进入市场 降低系统运行的风险 】。 的条件,其中最重要的一项就是产品的安全认证制度。 在电气、电子产品安全认证方面,最重要的步骤就是做 1设计的内涵 好产品的安全设计 。 通过对潜在的危险进行分析,提出相应的防范措施, 电子设备由于各种原因而发生失效 ,无法正确执行 使人一机 一环境相协调 ,减少危险事故的发生。设计的 预定的功能 ,从而导致灾难事故的发生,由此,电子设 内涵和种类分别如图1。 备的安全性应运而生。电子设备的安全性研究是安全相 关系统 (Safety—relatedSystem,SRS)的一类 ,是保障生产安 2安全性设计 全的重要措施 ,它应在危险事件发生之前正确地执行其 2.1设备的选用 安全功能 ,避免或减少事故的发生。 2.1.1材料选择 EnvironmentalTechnology·April201440 -● nvironmentalAdaptabi1il环境适应性和可靠性 很多设备的失效是由所用材料的质量和性能问题造 设计时应确保材料的使用寿命并满足工作强度等要求。 成的。材料的选用要遵循以下原则 : 对于易老化敏感的材料,定期检查,做到及时发现立即 1)材料的选取应满足工作环境要求和受力的安全要 更换。 求 ; 2.1.2三防设计 2)避免选用对人体有害的材料 ,如 j防设计是指防潮 、防盐雾和防霉设计..材料的选 ①含有致癌物的材料; 取上 ,金属器件应进行表面防腐处理或采用耐腐蚀性材 ②含水银等有毒材料; 料等,如防锈合金 、三防漆等,应保证金属器件不会因 ③能释放与大气化合形成酸或腐蚀性碱的气体材料 , 各种腐蚀失效而对人、其他设备及环境造成危害。需防 能释放有毒烟雾和易爆炸气体的材料等 。 水的设备 ,防水设计应达到预期的性能,并且设计的结 若必须采用上述材料时,应须采用安全技术措施和 构要合理,要达到 防的目的 。 提示性安全措施。 对露天工作的设备,除达到上诉设计外,也要对尘土、 3)造成材料变质的原因有很多,如工作环境、生物 、 高温、低温等进行设计。 电磁、老化 、应力等 ,选材上应符合国家、行业标准, 2.1.3防误碰措施 对潜在的由意外操作而导致危险情况 的发生,应设有防误碰措施。对重要的 或会造成严重后果的启动开关 ,必要时可 以覆盖操作件 、添加防护栏装置等结构 措施。 2.1.4热安全设计 在规定条件下 ,所有的设备 、部件、 器件的工作温度不得超过GB8898规定。 对于设备中高热易损的装置 、部件或器 件应有过热保护措施。为防止过热和过 冷对人员伤害,可在人员和设备之间设 图 1设计的内涵 置隔热层或辐射屏蔽,并应采取防接触 遮蔽措施或提示性安全措施。 2.1.5防火、防爆炸设计 设备在工艺设计和制造的过程中,对 元件、材料等的选取应首先选择具有不 易燃烧或阻燃性质的,对所使用具有易 燃、易爆等性质的物件时,应采取严格 、 有效的保护措施来达到防火、防爆炸设 计。设备的使用应尽可能远离高温环境。 对潜在的火源进行分析确定,有必要的 消防器材 ,可以采用设置防火墙、防爆墙、 图2设计的种类 41 2014年o4月 ·环境技术 nvironmen, talAdaptabi1iI 环境适应性和可靠性_■ 泄压设备等措施,必要时配备着火告警设备。设置火灾 安全色即是能表达出安全信息的颜色,分为红、蓝、 探测器 ,早发现早控制。 黄、绿四种颜色,分别表示禁止 、指令、警告、安全等信息。 对电真空器件 ,应严格选材 ,并须设有足够强度的 对色彩的选用应按GB2893—2008严格执行。 防护装置,以减小爆炸时对周围人员、设备的伤害。对 2.3电气、辐射的安全性设计 超过 1个标准大气压的充气 、充液等的压力容器 ,设计 2.3.1防止电气伤害 的安全系数要适当及有相应的过压安全阀等措施 ,防止 1)防止触及带电件 :通过加强绝缘或双重绝缘将带 承受过大的压力而爆炸 】。 危险电压的零部件与可触及件隔离。 锂电池使用不当会引起燃烧、爆炸。应给出警告, 2)防止危险带电件与可触及件之间的绝缘击穿 ,根 设计上应采用限流电路、采用过流保护元件等措施防止 据产品工作的环境条件,如:工作时长、机械应力、环 放电电流和反向电流超过电池制造厂规定的允许值。 境温度 、空气湿度 、污染状况等选择合适的绝缘材料。 2-2工作环境的安全性设计 对绝缘系统的结构设计要有有足够的绝缘穿透距离 、爬 2.2.1安全出入 口 电距离、电气间隙等。 工作室除设有人员进 出的门外,也应配有一个紧急 3)防接触电流过大 安全出入 口,且开启操作简单:疗便,其位置应清楚标明, ①降低隔离电容的容量 ; 附近不应有杂物。 ②设备中的接地连接要可靠,防止因任何意外而导 2.2.2温度设计 致人员伤害和设备受损; 为使工作者的环境温度适宜,对工作环境所设计的 ③设置补偿电路来达到降低电容电流 ; 温度要合理。通常是选用空调、加湿器等设备,来调整 ④设置消弧线圈,并使消弧线圈能快速准确做补偿 温度 、湿度等参数以保证人体正常的生理特点。 调整与校正电感值 。 2.2.3防噪声设计 2.3.2静 电的防护 噪声可造成工作人员耳部的不适 ,如耳鸣、听力受 近年来 ,在我国因静 电原因引起的事故屡见不鲜, 损甚至耳聋等,另外还易产生疲劳感或烦燥情绪,严重 其中损失巨大的有 :上海某石化公司的2000m 甲苯罐事 时可影响工作效率,甚至可能造成误操作的危险。 故;山东某石化公司的胶渣罐事故;抚顺某石化公司的 在人员工作岗位上的噪声强度不大于70dB,无操作 航煤罐事故等。 人员时的噪声强度应不大于 80dB。 通过摩擦及各种能量的作用会产生静电,选用适 当 如果噪声将不可避免地超过允许值时,应设计隔音 材料及形状,增大电导率等抑制措施外 ,还可采取下列 屏 、隔音墙等,对于需要在强噪声环境中工作的人员 , 措施 : 可以配备头盔、轮班休息等措施来保证人员的生理健康。 1)要有 良好的接地系统。工作 (实验 )台、桌椅等 2.2.4照明安全 要接地,须有防静电工作服(衣服、帽子 、鞋、静电手环等) 照明安全是关乎设备和人员安全的重要环境要素。 以保证静电对人体和设备的影响; 充足的光源可以避免因灯光不足或过强及而造成操作失 2)屏蔽。采用静电屏蔽可将静电危害限制到最低或 误。通常操作区的照度应 5401x一7551x。 者不发生,还可防止仪器设备受到静电干扰; 2.2.5安全标志 3)对绝缘体带电可采用中和的方法; 设备上必须标有能清晰长久保存的标牌,其上要标 4)湿润的环境可以抑制静电的产生,可以采用加湿 出该设备的主要特征、操作类型说明及警示标志等。 器等来实现。 EnvironmentalTechnology·April201442 —■ nvironment。a1AdaPfabiliI环境适应性和可靠性 2.3_3防辐射 滤波可以将信号中某些特定频率的信号过滤 ,达到 1)电离辐射 抑制和防止干扰的作用。一般加载滤波器等措施。 电离辐射是释放电子的过程 ,特点是具有波长短、 接地起到防止外部电磁场的干扰,可以把多余的电 能量高。其中质子、 粒子、B粒子带 电, 射线、 荷释放掉 ,接地起到避免设备和人员遭受电源泄露或者 X射线和中子不带电。影响因素有: 静电放电的作用 。 ①接受辐射时间的长短。接受辐射时间越长 ,受到 的影响越大; 3总结 ②距离。不同的射线辐射距离也不同,如 x射线比 随着科技的发展,电子设备的功能越来越多 ,组成 射线射程近; 结构越来越复杂 ,自动化程度越来越高,设备发生安全事 ③屏蔽。设立屏蔽墙 (屏 )等来达到保护工作人员 故的可能性也不断增大 ,加强安全性的设计与研究显得 的 目的。 十分迫切。鉴于中国在全球制造环节和设计环节的重要 2)激光辐射 地位 ,使得中国成为全球各大仪器厂商青睐的大战场, 激光是波长为 180nm~lmm的所有的电磁波,具有定 随着 国产设备销往世界 ,因此必须要符合世界各地的安 向、能量高、发散度小等的特点。激光辐射可引起人体 全标准。我国的电子设备要走出国门面向全球化市场 , 乏力、头痛、心律失常、灼伤皮肤、损伤细胞、视力下 首先第一步就是解决电子设备的安全性问题。 降甚至失明等。可采取防护罩 、挡板、遥控操作等措施 避免工作人员直接暴露在激光的辐射范围内;设立警告 标志,防止非工作人员靠近等。 3)电磁防护 ①危害 : 强 电磁辐射可对人体神经、生殖等系统造成伤害, 引发癌症等 ,可令孕妇流产 、畸胎等。 未来是高科技的时代,国防建设中对于能制敌与无 参考文献 形的武器——电磁脉冲武器 ,它产生的辐射在电路之间 1【】刘芳芳 .电子设备可靠性设计方法研究 J【】电子测试,2007(2):99— 及半导体之间产生感应电流,对电子设备造成干扰,甚 103. [2】莫世禹 舰艇通信设备安全性设计 [C】.安顺:第六届电子产品防护 至使电子元件、集成电路烧毁,使敌方设备失控,丧失 技术研讨会 ,2008:176—179 战斗力。 3【】路龙龙 石伟 电子结构的三防设计 [J].电子元器件应用 2012, ②防护技术 : 14(7):11—13 [4]戈进飞 军用电子设备结构安全性设计概述 [J]电子机械工程 , 电磁防护技术一般有屏蔽、接地、滤波等。 2010,26(5):1—6 屏蔽一般又分为电屏蔽、磁屏蔽和电磁屏蔽。屏蔽 f5l杨鞭 浅析6~ 1OkV电网中电容电流的危害及防治 [J].能源技术与 管理 ,201O(31:132一l33 主要是指减弱电磁向外辐射并减弱外部的电磁对设备的 [6】郭建飞 车辆电控系统电磁防护技术研究 D[】.长春:吉林大学 , 20136 影响来达到 目的的。电屏蔽一般用于辐射频率较高时, 磁屏蔽一般用于频率较低时,当有复合电磁场的干扰一 作者简介 般用电磁屏蔽。通过屏蔽,可以保护设备免受外部电磁 自伟 (1989一)。男,山西长治人,在读硕士研究生,主要从事电子测 试设备安全性的设计及研究。 的干扰和冲击,同时能有效的保护信息被窃取。 43 20l4年04月 ·环境技术 热带作物学报 2014,35(10):1969—1974 ChineseJournalofTropicalCrops 番茄S1ARF2基因表达模式及其 在果实发育中的功能分析 杨 枭,任振新 ,林冬波,先志强,李正国 妻重庆享市高校功能鑫基篙因蔫与簧调控囊新技术重点实墓验室 重王庆400030 摘 要 为 了分析 SlARF2基 因在番茄生长发育过程 中的功能.利用定量 PCR技术分析 SlARF2基 因的表达模 式,发现SlARF2基 因在番茄花芽中表达量最高,在幼果 中次之 ,说明SlARF2基 因可能在番茄花果发育中起着 重要作用。为进一步研究 SlARF2的功能 ,构建 S1ARF2基 因超表达 、抑制表达载体 ,农杆菌介导转化番茄成功 获得了相应转基 因植株 。通过与野生型番茄植株花 、果不 同时期 的表 型进行 比对分析 ,发现 SlARF2基 因的超 表达对花的形态学特征无明显影响 。但能够显著提高植株的结实率、降低果实大小和重量。说明 sA/RF2基因 参与调控番茄花、果发育过程 。 关键词 番茄 ;SA/RF2;表达模式 ;果实发育 中图分类号 $641.2 文献标识码 A TheExpression Pattern ofSIARF2 in Tomato and the FunctiOn Analysisin Tomato FruitDevelopment YANG Xiao,REN Zhenxin,LIN Dongbo,XIAN Zhiqiang,LIZhengguo GeneticEngineeringResearchCenter,SchoolofLfieSciences,ChongqingUniversity/KeyLabofFu~twndGene andNewRegulationTechnologiesof ChongqingMunicipalEducationCommission,Chongqing400030,China Abstract To investigate thefunction ofSbtRF2 in tomato development,weanalyzed the expression pattern of S 足 by Real—time PCR.We ofund thatS/ARF2 washighly expressed in tomato bud and immature fruit. suggestingthatSlARF2playsan importantroleintomatoflowerand fruitdevelopment.Furthermore,we constructed SlARF2 overexpression and suppress expression vectors.By agrobacterium infection,we finally obtained the SlARF2 overexpression and suppress transgenetic tomatoes.Compared the transgenetic tomatoes to wild type tomato,we found thatSlARF2 had no affection in hte morphology offlower,however SlARF2 overexpression strongly enhanced the rape rate oftomato and decreased hte size oftomato furit.1’I1e study demonstrates that SlAR1;2 regulates hte developmentoftomato flowerand furit,and providesbasic reference forfurtherstudy of .s F2 function. Key words Tomato;SlARF2;Expression pattern;Furitdevelopment doi 10.39690.issn.1000—2561.2014.10.015 生长素是植物生长激素 中最为重要 的一种激 拟南芥、土豆 、水稻、葡萄ARF家族成员的蛋 白 素.通过调节早期生长素响应基因的表达 .调控植 质序列 比对分析 .建立系统进化树 .将ARF家族 物生长发育的多个阶段如 :顶端优势、向性生长 、 划分为 四个分支 。其 中。ARF Ia。IIb,IIIand 侧根 的形成、微管的分化、胚胎发育等[1]。在早期 IV 亚家族基 因的蛋 白中间区域含有一个抑制功能 生长素响应基因的启动子区域包含一个保守的顺式作 域 .推测这些亚家族 的ARF蛋 白为转录抑制子 。 用元件 TGTCTC.称为生长素响应元件 (AuxRE)园。 ARF2基因属于 ARFIa亚家族成员 .作为一个潜 能够与该元件结合并调节生长素响应 的一种转录因 在的生长素负调控转录因子 .已经在多种模式植物 子称为生长素响应因子 (auxinresponsefactorARFs) 中被克隆研究。在拟南芥 中, 突变体表现出对 ARFs是植物生长素信号途径 中一个重要的转录因 植物生长发育多向性 的调节影 响,包括植株变大、 子 .它正向或者反 向的调控生长素相关基因的表 组织形态异常等[61ARF2基 因在植物生长发育的 达 ,从而调控植物生长发育过程3[]。通过对番茄、 多个阶段都有表达 , 突变体在植物衰老的多个 收稿Et期 2014—04—20 修 回日期 2014—09一O1 基金项 目 国家863课题 (N0.2012AA101702);国家 自然科学基金(N0.31272166);重庆市重点自然科学基金项 目(No.2011BA1024);教育部 博士点基金 (No.029)。 作者简介 杨 枭 (199O年一),男,硕士研究生;研究方向:植物激素信号转导。}通讯作:i~(Correspondingauthor):李正国(LJZhengguo), E-maih .cn。 一 1970- 热 带作 物 学报 第 35卷 过程中均表现出明显的延迟现象,包括花的脱落. Template≤200ng.PrimeSTAR HS DNA Polymerase 叶的衰老以及角果 的成熟 。有研究发现 .arf2突 0.5 L,加 ddH2O至 50 L。PCR产物经胶 回收后 变能促使组织细胞分裂增强, 突变株系中。茎 连接至 pEASY—Blunt克隆载体 。测序验证 测序 和莲座 中与细胞周期相关的 CYCD3;基 因和与细 结果通过 DNAMAN软件与拟南芥ARF2基 因序列 胞分裂相关的ANT基因表达时期都被相应的延长. 比对进行相似性分析 .通过 NCBIBlast进行蛋 白 说明AR 是一个细胞分裂和组织发育的抑制因 序列结构功能域分析 子8[]。ARF2还介导生长素与其他植物激素的互作 1.2.2 组织表达模式分析 Triz0l法提取番茄各组 乙烯可 以通过蛋 白酶体途径介导ARF2蛋 白的降 织器官总RNA,组织器官分别为根 (R)、茎 (S1、叶 解 .并且该过程与 乙烯促进生长素的合成途径是相 (L)、花芽(B)、花(FL)、幼果(IM)、绿熟(MG)、黄果 互独立的[9.101在生长素和 ABA交互通路 中ARF2 (YF)、红果 (Re)。OD 0D2 1.8~2.0,以2I.LgRNA 与HB33作为新型的调控因子 .对植物生长起着重 为模板 .经DNaseI消化 30min后反转录合成第 要的调控作用n【] 油菜素 内酯 (BR)调控通路 中的 — — 链 cDNA,以弓I物ARF2一F,ARF2一R,SlActin—F, 重要基因BIN2磷酸化会导致ARF2的DNA结合和 SlActin—R[1】](表1)分别扩增 目的基 因和 内参基 因 抑制能力缺失 .BIN2通过钝化 ARFs增强生长素 按照 MaximaSYBR Green/FluoresceinqPCR Master 诱导基 因的表达 [12】。ARF2对番茄生长与发育具体 Mix(2X) 125 L,ForwardPrimer0.3wmol/L,Reverse 的调控功能.尤其是对花和果实发育的作用至今仍 Primer0.3~mol/L,cDNA≤100ng.力ⅡddH20至 不清楚 。本文以番茄 IsIARF2基因作为研究 目标 . 25 L反应体系进行扩增反应,为了确保结果的可 分析其在番茄花与果实发育中的功能 .以期为明确 靠性 ,每个反应设置 3次重复。PCR程序设置为 : 番茄 SIARF2的发育调控功能奠定基础 50℃ 2min;95oC 10min;95cI= 15S,60oC 30S, 72℃ 30S.40个循环。PCR扩增结束后立即进行 1 材料与方法 熔解曲线分析.以验证扩增的特异性 熔解 曲线cc开始 1.1.1 植物材料 番茄 ‘册z册 lycopersicum.CVMicro 每升高 0.5℃保持 10S.连续升高 80次 。数据处 Tom)、大肠杆菌 JM109和农杆菌 (Agrobacterium) 理 :实 时荧光定量 PCR反应完成后 ,iCyclerMT 菌株 C58由本实验室保存 softwareversion3.0自动计算出各个板位的CT.将 1.1.2 试剂 T4DNA连接酶 、限制性 内切酶及反 CT值输入到Microso~Excel2003中.按照公式△ 转录试剂盒购 自Fermentas公司 (USA),PrimeSTAR ACT=[(C Target-CT Reference)sample A-(cr 高保真 DNA聚合酶购 自TaKaRa公司(大连),质 Target—CTReference)sampleB11l【3】,采用 2-AACT法分 粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购 自OMEGA 析定量数据 .计算基因的相对表达量 .并绘制基因 公司(USA),总RNA抽提试剂Trizol购 自Invitrogen 表达差异 的柱形图。其 中.CTTarget表示 目的基 公司(USA),其他生化试剂购 自鼎国生物技术有限 因的CT值 .CTReference表示内参基 因的CT值 公 司f北京 1,Real—timePCR所 用 试剂 Maxima⑧ 表1 本实验所用到的引物序列 SYBR Green/FluoresceinqPCR MasterMix(2X)购 自 Table1 Theprimesusedintheexperiments Fermentas公司(USA),用于番茄组织培养的MS培 养基购 自Sigma公司:所有引物合成和测序工作均 引物名称 引物序列 5-3 由南京金斯瑞生物科技有 限公司完成 F1 CGCGGATCC(BamHI)An’AGTGTACGGAAATGGCTGC R1 GGCTCTAGA(XbaI)CGTGATCCTAAGATTCTGCITI’G 1.2 方法 Fs CGCTC AGA(baI)AGACCGAG兀-FCACCGTGG 1.2.1 ARF2基 因的克隆及序 列分析 Trizol法提 Rs CGCGGATCC(BamHI)TCTCCCCGCATITGATAGG 取番茄各组织器官总 RNA,ODz~olOD~o=1.8~2.0, AR 一F GCAAGGTCAAGAGTrATCGA 以2 gRNA为模板 ,经 DNaseI消化 30min后 A 2一R CATTGGTITCTCAGACAAGTC 反转录合成第一链 cDNA(步骤参照说明书) 取各 SlActin-F TGTCCCTAITITI1ACGAGGGTTATGC 组织 cDNA等比例混样 .以之为模板 ,以引物 Fl, JsM ctin—R AGITAAATCACGACCAGCAAGAT R1(表 1),高保真DNA聚合酶扩增 .s/ARF2基因。 加样 比例为 :5xPrimeSTAR Buffer10lxL.dNTP 1.2.3 植物表达载体 的构建 克隆S1ARF2基 因 Mixture(2.5mmol/L1,引物1、2各 0.2~0.3Ixmol/L, 全长 时.在引物 F1的 5端设计加入 BamH I酶切 第 l0期 杨 枭等 :番茄S RF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析 一197l一 位点 .在 引物 F2 的 5端设计加入 Xb口I酶切位 1.2.5 植物表型鉴定 结实率=所收获的果实数/ 点。克隆得到具有 BamH I、XbaI双酶切位点的 开花数。番茄果实直径大小用游标卡尺测量。 全长基因。BamH I、XbⅡl双酶切处理 DCAMBIA一 1.3 数据处理 35S载体 。37qC,1h,胶 回收纯化。T4连接酶连 所得数据用 Excel进行方差分析 .最小显著差 接 处理过 后的 S 基 冈片段 和 DCAMBIA一35S 数法 (LSD法)进行显著性分析,每个数据样本nI5, 载体 ,16oC过夜 ,转入大肠杆菌 菌落 PCR筛选 不同的字母代表差异显著 , 代表差异极显著. 鉴定 阳性 克隆 ,提质粒 ,得 到 pCAMBIA一35S— 代表差异显著 S1ARF2超表达载体 。选取全长基因中约 600bD的 基因片段 .设计 引物 Fs和 Rs.在 Fs的 5端设计 2 结果与分析 加 入 Xb I酶 切 位 点 .在 Rs的 5端 设 计 加 入 2.1 A足F2基因的克隆与结构功能域分析 BamH I酶 切位点 克 隆得 到的基 因片段连接至 以番茄总 RNA反转录成的cDNA为模板 .用特 BamH I、 6ⅡI双酶切 处理 的pCAMBIA一35S载 异性引物 F1和R1进行PCR反应 ,得到约2560bp 体。筛选阳性克隆,提质粒,得到pCAMBIA一35S— 的片段 (图 1一A) 将测序结果与数据库 中番茄 asARF2反义抑制载体 1.2.4 转基 因植株获得及鉴定 叶盘法转化番茄. SlARF2基 因 比对 .确认 所得 片段为 ARF2基 因 经卡那霉素抗性筛选 ,GUS报告基 因染色筛选 . 番茄A尺 基因与拟南芥 A尺 基因的蛋 白质序列 初步获得阳性转基因植株l14l转基因植物 S 尺 比对 .相似性为 61.7%.2个基因都含有 3个明显 基因表达量鉴定 :取各植株同一时期植株叶片提取 的 保 守 结 构 功 能 区 域 Domain I、Domain II、 RNA反转录 cDNA.以之为模板进行定量 PCR检 DomainIII(图 l—B),这 3个保守结构功能域分别 测 (具体步骤见组织表达模式分析).得到各株 系 为 B3一DNA结合 区域 、Auxinresponsefactor生长 .sA/RF2基因表达量 .以野生型 中LsA/RF2表达量 素响应区域以及AUX/IAA家族基因转录激活区域 . 为 1。确定转基因植株是否超表达或抑制表达 属于典型的ARF家族保守结构功能域 A bp AtARF2seq脯孽 嚣爱 灌薏嗣_ 翻 hn (”‘ ““s ” 。 窜 。 = d 。iy 1 。#l : 500o ARF2, 2560 t 30oO AR . se圈重罾l蛋羹莲冒雷舞羞薏曩薯目匿薯薏聋薯鐾羞l Ij Co[1s{~nsus :pq0 :eqVea : aqqxq=l p5 lc:V V lae0:deVYaqtl e:qde~a ke FF :fvh 2000 AtARF2.seq 243 BIARF2.seq 225 Consensus sf k:lc^,卷:3tn口口t, 1r: ade0l 1衄 31a窄C0qtiv^kdlh nt zfzhlf=a口口r! lla3avSVfVS$~rIV lx【M】 750 AtARF2.seq 324 BIARF2.seq 3o6 Consensus AtARF2.seq 405 BlARF2.seq 387 Consensus tARF2. -ARF:. se,I嚣匿孽圜量重 墨耄薏 _ 薏善莲蘧霪墨酒耄童飘;222 IARF2. 。 . se墨孽 塞墨葚I :曩饕童疆 嚣疆重童溜耄渭 l ; IARF2.se 。 Fz. 。 誊亳 谭蘧篡羡强鬈曼蘧霪童蘧稍 鬈 凄 蓉 瑁643 IARF2.s . 州eq善意懑;翟暖誉 器瓢 i圜薯■ 嚣誊 AtARF2.seq 795 BIARF2.seq ; 782 Consensus AtARF2.seq BIARF2.seq Consensus 图1 SfAR 基 因扩增及结构功能域分析 Fig.1 ThecloningandtheFunctionDomainanalysisofARF2Gene 一 1972一 热 带 作 物 学报 第 35卷 2.2 SIARF2植物表达载体的构建 表明,基因序列及连接方 向正确 。表 明成功构建 将带有酶切位点的S1ARF2全长基 因和 中间 了SlARF2超表达载体 pCAMBIA一35S—SIARF2和 片段 .连接 至酶切处 理 的 pCAMBIA一35S植物 表 反 义 抑 制 载 体 pCAMBIA一35S—asARF2(图 2)。 达载体 ,转化 大肠杆菌 ,经 PCR、酶切验证 。 通过冻融法将成功构建 的表达载体转入农杆菌 确定 目的片段 已成功 的连接到载体 。测序结果 C58中。 pCAMBIA—-35S—-asARF2 图2 SIARF2植物表达载体的构建 Fig.2 TheconstructionofSIARF2expressionvector 2.3 SIARF2基 因在番茄各组织中的表达模式分析 育过程 中的功能 .设计构建 .S/ARF2基 冈的超表达 定量 PCR分析 SA/RF2的表达模式 结果发现 及反义抑制载体 .通过遗传转化成功获得了4个超 在番茄根、茎 、叶营养生长阶段 S 尺 的表达量 表达转基 因株 系 ,ARF2—1、ARF2—3、ARF2—4、 呈明显的上升趋势.在根中表达最低 .茎的表达量 ARF2—5和 1个反义抑制转基 因株系 As—ARF2 提 约为根中的 l0倍 .叶的表达最高 .约为根中的 13 取各转基 因植株 60d的叶片 RNA.反转录得 到的 倍 进人生殖生长阶段后的花芽期达到最高 .约为 cDNA.定量 PCR检测各个植株 的转基 因表达情 根 中表达量的 17倍 .花和幼果时期的表达量有所 况 。结果表明.转基 冈株系 ARF2—1、ARF2—3中 下降,为根 中表达量的 12倍左右 .在果实发育阶 A尺 基因的表达量较高.约为野生型表达量的 13 段 Js/ARF2的表达量 明显下降并趋于平稳 .为根 中 倍 .ARF2—4植株 S/ARF2的表达量较低 ,约为野 表达量的 5~7倍 (图 3)。由此推测 Ls 基 因对 生型表达量的 7倍 .ARF2—5植株 的Js R 表达 番茄花以及果实的发育形成具有调控作用 量相对野生 型无 明显变化 .反义抑制植株 As— ARF2中5 R 基因的表达量 明显降低 .约为野 生型中表达量的0.5倍 (冈4一A)。通过统计植物开 15 花期各转基因植株的开花数量.并与相同生长条件 下 同时期的野生型植株进行对 比.结果表明.开 圜 醐 l0 花期各转基 因植株的开花数量基本一致 (平均每 株 25朵左 右 ).证 明ARF2基 冈表达量的差异并 器 5 不能对花的形成产生明显的影响 在番茄幼果形成期 .对各转基因株系的结实率 O 进行统计 ,结果显示:4个SA/RF2超表达转基因株 R:根;S:茎 ;L:11-r;B:诧芽 ;FI:花 ; 系的结实率明显高于野生型植株.其中ARF2—3株系 IM:幼果 ;MG:绿熟 ;YF:黄果 ;Re:红果。 的结实率最高 .ARF2—5次之 .ARF2—4和ARF2—1 R:root;S:stem;L.1eaf;B:bud;Fhflower;IM:immature MG:Maturegreen;YF:Yellowfruit;Re:redfurit. 相对于野生型植株也相应增高 .As—ARF2反义抑 图3 番茄S RF2基 因表达模式分析 制株系的结实率明显低于野生型植株 (图4一B)..证 Fig.3 ExpressionpatternofSIARF2intoma~ 明S 尺 基因的超表达对果实座果有着一定的促 2.4 刚 基因在果实形成发育中的功能分析 进作用。进一步对成熟期果实进行统计分析。结果 为了分析番茄 .s/ARF2基 因在番茄果实形成发 发现.各转基因株系的果实在数量 、大小以及重量 笫 10期 杨 枭等 :番茄SfARF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析 一1973一 r兽 盟醐 《 目眦,÷ 涮林眯 上有着明显的差异 ARF2—加3的果实大m小、重量明O 大∞小、∞重量如的变加化成m明显0的线一E)。以 显小于其他各株系 。ARF2—4、ARF2—1株系 的果 上一数据表 明.随着 SlARF2基 因表达量 的提高 , 实大小 、重量也明显小于野生型植株果实 。ARF2—5 转基因株系果实的大小和重量相应减小 株系以及 As—ARF2反义抑制株系的果实大小、重量 综上所述 .在番茄果实发育过程 中SlARF2基 与野生型果实相比无明显变化 (图4一C、D:图5)。 因显著影响了植株的结实率 、果实大小和重量 ,证 同时S RF2基因表达量的变化与转基因植株果实 明A 基因是调控果实发育的一个重要因子 0-8 0·6 槲 04‘ O·2 0·0 1O 8 bo 面 6 4 2 0 大小) 重量 ) 20 I5 l0 5 O A:ARF2表达量 ;B:结实率 ;C:果实直径;D:果实重量 ;E:表达量与果实大小 、重量关系间的回归分析。 A:expressionquantitiesofARF2;B:ripeningrate;C:fruitdiameter;D:fruitweight:E:linearregressionanalysis. 图4 足 各株系果实表型分析 Fig.4 Analysisthephenotypeoffruit 一 l974- 热 带 作物 学报 第 35卷 异 .同时各 S R 超表达株系的果实呈现圆润且 饱满 .而野生型果实的底部明显尖细且果实呈心型 (图5).这与同家族基因 5 尺 的研究具有一致 性I15_.从形态学分析 .可能是 由于 SA/RF2直接影 响了番茄的细胞分裂所致 但结合结实率受影响这 一 结果 .推测可能是因为5 R 基因在果实形成过 程中影响了营养的分配所致 .对此尚有待深入研究 参考文献 【1]KumarR,Ty AK,SharmaAK,et .Genome-widenaalysis ofauxinresponsefactor(ARF)genefamilyfromtomatoandanalysis oftheirroleinflowerandfruitdevelopment[J].MolGenetC~nomics, 2011.285(3):245—260. 2【】GuilfoyleTJUlmasovT,HagenG,eto1.TileARFfambYof transcription factorsand theirrole in planthormone—responsive transcriptionJ[].CellMolLifeSci,1998,54(7):619-627. 3【]GuilfoyleTJ,HagenG Auxinresponsehctors[]j.Curr()pinPlant Biol,2007,1O(5):453-460. [4]TiwariSB,HagenG,GuilofyleT.Therolesofauxinresponse 图5 各转基 因株系番茄果实形状 factordomainsin auxin—responsive transcription[J].PlantCell, Fig.5 ThecomparisonofeachTransgenictomatofruit 2003,l5(2):533—543. 5【】MohamedZ,FuY,Chateigner—BoutinA L,eta1.Characterization 3 讨论与结论 oftheTomatoARF Gene Family UncoversaMulti-LevelsPost- TranscriptionalRegulationIncludingAlternativeSplicing[J].Plos 本研究以番茄SIARF2基因为对象 。成功构建 One,2014,9(1):1-12. 了Ls 尺 基因的超表达和反义抑制载体 .并获得 [6】OkushimaY,MitinaI,QuachH L,eta1.AUXINRESPONSE 了相应 的转基 因植株作为后续分析材料 通过对 FACTOR2(ARF2):apleiotropicdevelopmentalregulator[J].Plant J,2oo5,43(1):29—46. .slARF2基因表达模式 的分析 .发现 .slARF2基 因 7【】EllisC M,NagpalP,YoungJC,eto1.AUXIN RESPONSE 的主要表达时期处于番茄的生殖生长阶段 .从花芽 FACTOR1nadAUXIN RESPONSE FACTOR2regulatesenescence 开始贯穿于花 、果发育的整个过程中 通过对所得 andfloralorganabscissioninArabidopsis£ JJ.Development, 2005.132(20):4563-4573. 到的转基 因株 系材料的花 、果分析发现 .SIARF2 [8]SchurffM CSpielman~ITiwaris,et以 TheAUXIN RESPONSE 基因在花蕾 中表达量最高 .在开放仡中表达量也较 FACTOR 2 geneofArba idopsislinksauxin signalling,celldivision, 高.但对花的形成并没有产生明显的影响 在其他 andthesizeofseedsandotherorgans[J].Development,2005, 133(2):251-261. 研究中。拟南芥 arf2突变株系 中会表现 出花形态 9【】LiH,JohnsonP,StepanovaA,etrJ』.ConvergenceofSignaling 异常 ,开花延迟和花序长而密集的表型[51。因此 , PathwaysintheControlofDifferentialCellGrowthni Ambi&~sis[J]. 为了明确 LslARF2基因在番茄花形成 阶段 的功能 . DevCell,2004,7(2):193—204. 还需要进一步对所得到的转基因植株开花时期的对 [10]RuzickaK,LjungK,VannesteS,eta1.Ethyleneregulatesroot gmwth Ⅱ effectson auxin biosynthesisnad trartsporl—dependent 应生理生化指标进行研究 auxindistribution[J].PlantCell,2007,19(7):2197—2212. 本研究通过对转基因植株的SlARF2基因表达 [11】WangI,HuaD,HeJ,et .AuxinResponseFactor2 (ARF2) 量 .结实率以及成熟后果实的统计分析.发现各植 na d Its Regulated Homeodomain Gene HB33 Mediate Abscisic AcidResponseinArabidopsis[J].PlosGenet,2011,7(7):l-14. 株 的结实率 、果实大小和重量与 基因的表 [12】VertG,WalcherCL,ChoryJ,eta/.Integrationofauxinand 达量呈 明显的线一E).S 尺 基 因表 brassinosteroidpathwaysbyAuxinResponseFactor2J[I.PNAS, 达量越高则结实率越高.成熟后的果实则越小 .这